Diagnostické přístupy pro detekci rakoviny plic

Rakovina plic je nejčastější příčinou úmrtí způsobených rakovinou na světě. Vysoká míra úmrtnosti a schopnost pacientů přežít pět let je méně než 15 % a je způsobena faktem, že 70 % diagnostikovaných karcinomů plic je už v pokročilé fázi. [1] Pracoviště na PřF UJEP je součástí projektu, jehož cílem je vývoj mikrofluidního čipu (MLC čip), který umožní izolovat (kvantifikovat) populace nádorových buněk.

 Obr. 1.: zachycené modelové rakovinné buňky s fluorescenčně označenými EpCAM receptory

Projekt probíhá ve spolupráci s Biotechnologickým ústavem AV ČR a Masarykovou nemocnicí v Ústí nad Labem. Projekt si klade za cíl propojit stávající přístupy separace CTC buněk a jejich další třídění dle epiteliálního/mesenchymálního fenotypu, tj. odstranit významné nedostatky stávajících řešení. Dílčí výsledky výzkumu byly úspěšně prezentovány na prestižních konferencích μTAS2017 a μTAS 2018.

Perfuzní mikrofluidní systém pro imuno-zachytávání buněk ve stop-flow režimu

Většina úmrtí souvisejících s rakovinou je způsobena krví přenosnými metastázemi iniciovanými cirkulujícími nádorovými buňkami (CTC) identifikovatelnými v krevním řečišti. CTC je různorodá populace rakovinových buněk, ne dobře definovaného složení, u kterých se předpokládá, že slouží jako metastatické prekurzory, které jsou schopné iniciovat klonální metastatické léze [3]. Informace o počtu těchto buněk v krevním řečišti v různých stádiích rakoviny jsou však velmi omezené.

 

Obr. 2: směs 2 různých buněčných kultur, červeně barveny modelové rakovinné buňky, zeleně barveny modelové buňky simulující krevní prostředí

Stávající technologie, které spoléhají na počítání CTC v periferní krvi na základě imunozachycení buněk, jsou založeny na přítomnosti specifických povrchových buněčných markerů, především na využití molekuly epitelové buněčné adheze (EpCAM) [4]. Tyto komerčně dostupné metody počítají s cca 1–50 CTC v 7,5 ml krve (v závislosti na typu rakoviny). Dosud bylo provedeno několik obsáhlejších studií s velkými počty pacientů pro zhodnocení klinické úspěšnost počítání CTC touto metodou, jakožto nezávislým prognostickým faktorem u pacientů s rakovinou prsu, prostaty a tlustého střeva [3].

Mikrofluidní čipy nachází stále častější uplatnění na poli lékařské diagnostiky. Jejich použití otevírá nové možnosti ve studiu chování buněk, jejich proliferace, buněčných odpovědí na různé podněty, separace buněk z tekutých biopsií a podobně. Manipulace s buňkami pacienta v lékařské diagnostice vyžaduje vysoké objemy chemikálií, je náchylná na chyby operátora a buňky jsou zkoumány v nepřirozeném prostředí in vitro („ve zkumavce“).

Obr 3.: připojený mikrosystém pro imuno-zachytávání buněk ve stop-flow režimu na stolku mikroskopu, připravený k experimentu

Mikrofluidní čipy umožnují pracovat pouze s malými objemy látek, tudíž jsou vhodné pro testy nových léčiv, kterých je k dispozici pouze velmi omezené množství. Díky svým rozměrům a designu napodobují cévy a tělní prostory, čehož je využíváno v konceptech „orgány na čipu“. Použití mikrofluidních čipů také umožnuje automatizaci veškerých testovacích procesů a lze tak získat velké množství dat během velmi krátké doby.

V poslední době se stále častěji objevují nové možnosti v oblasti vývoje mikrofluidních systémů pro izolaci vzácných buněk jako jsou CTC nebo kmenové buňky. Principy separace v takových systémech jsou většinou podobné výše uvedeným standardním technikám. Imunochemické systémy [5 – 7] obvykle používají komerčně dostupné anti-EpCAM IgG (protilátka) navázané v mikrofluidních kanálcích, které zvyšují pravděpodobnost zachycení CTC. Po zachycení CTC obvykle následuje imunofluorescenční barvení hlavních epiteliálních markerů, které se používají k identifikaci a stanovení počtu buněk. Ačkoli některé systémy vykazují výborné vlastnosti v zachycování CTC, stále trpí podobnými nedostatky jako standardní metody zmíněné výše.

Obr. 4: mikrofluidní filtrační jednotka filtrující krev pro imunozachycovací systém jako forma předpřípravy vzorku

Nedostatek propracovanějšího třídění, stejně jako absence volitelného uvolnění buněk z mikrosystému pro další kultivaci nebo analýzu pro jednobuněčné RT-PCR, jsou hlavními omezeními všech výše uvedených metod.

Výše popsané diagnostické metody mohou na základě molekulárních aberací specifických pro pacienta umožnit sledování progrese rakoviny a pomoci tak cíleněji zaměřit terapii. [2] Nové diagnostické přístupy pro včasnou detekci plicních adenokarcinomů, jakož i nové pohledy na molekulární mechanismy způsobující patogenezi adenokarcinomu plic, jsou tedy naléhavě zapotřebí.

Kontakty:

Mgr. Jan Malý, Ph.D., jan.maly@ujep.cz , PřF UJEP
Mgr. Marcel Štofik, Ph.D., marcel.stofik@ujep.cz, PřF UJEP
Mgr. Jiří Smejkal, jiri.smejkal@ujep.cz, PřF UJEP
Mgr. Petr Aubrecht, petr.aubrecht@ujep.cz, PřF UJEP

Projekty MATEQ
Výzkumné týmy MATEQ

 

Reference:
[1] OKADA, Morihito, Wataru NISHIO, Toshihiko SAKAMOTO, Kazuya UCHINO, Tsuyoshi YUKI, Akio NAKAGAWA a Noriaki TSUBOTA. Effect of tumor size on prognosis in patients with non-small cell lung cancer: the role of segmentectomy as a type of lesser resection. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery [online]. 2005, 129(1), 87–93. ISSN 0022-5223. Dostupné z: doi:10.1016/j.jtcvs.2004.04.030

[2] ZHANG, Jing, Xiao-Yu CHEN, Ke-Jian HUANG, Wei-Dong WU, Tao JIANG, Jun CAO, Li-Sheng ZHOU, ZhengJun QIU a Chen HUANG. Expression of FoxM1 and the EMT-associated protein E-cadherin in gastric cancer and its clinical significance. Oncology Letters [online]. 2016, 12(4), 2445–2450. ISSN 1792-1074. Dostupné z: doi:10.3892/ol.2016.4917

[3] YU, Min, Shannon STOTT, Mehmet TONER, Shyamala MAHESWARAN a Daniel A. HABER. Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization. The Journal of Cell Biology [online]. 2011, 192(3), 373–382. ISSN 1540-8140. Dostupné z: doi:10.1083/jcb.201010021

[4] RIETHDORF, Sabine, Herbert FRITSCHE, Volkmar MÜLLER, Thomas RAU, Christian SCHINDLBECK, Brigitte RACK, Wolfgang JANNI, Cornelia COITH, Katrin BECK, Fritz JÄNICKE, Summer JACKSON, Terrie GORNET, Massimo CRISTOFANILLI a Klaus PANTEL. Detection of circulating tumor cells in peripheral blood of patients with metastatic breast cancer: a validation study of the CellSearch system. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research [online]. 2007, 13(3), 920–928. ISSN 1078-0432. Dostupné z: doi:10.1158/1078-0432.CCR-06-1695

[5] STOTT, Shannon L., Chia-Hsien HSU, Dina I. TSUKROV, Min YU, David T. MIYAMOTO, Belinda A. WALTMAN, S. Michael ROTHENBERG, Ajay M. SHAH, Malgorzata E. SMAS, George K. KORIR, Frederick P. FLOYD, Anna J. GILMAN, Jenna B. LORD, Daniel WINOKUR, Simeon SPRINGER, Daniel IRIMIA, Sunitha NAGRATH, Lecia V. SEQUIST, Richard J. LEE, Kurt J. ISSELBACHER, Shyamala MAHESWARAN, Daniel A. HABER a Mehmet TONER. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America [online]. 2010, 107(43), 18392–18397. ISSN 1091-6490. Dostupné z: doi:10.1073/pnas.1012539107

[6] KIRBY, Brian J., Mona JODARI, Matthew S. LOFTUS, Gunjan GAKHAR, Erica D. PRATT, Chantal CHANELVOS, Jason P. GLEGHORN, Steven M. SANTANA, He LIU, James P. SMITH, Vicente N. NAVARRO, Scott T. TAGAWA, Neil H. BANDER, David M. NANUS a Paraskevi GIANNAKAKOU. Functional characterization of circulating tumor cells with a prostate-cancer-specific microfluidic device. PloS One [online]. 2012, 7(4), e35976. ISSN 1932-6203. Dostupné z: doi:10.1371/journal.pone.0035976

[7] THEGE, Fredrik I., Timothy B. LANNIN, Trisha N. SAHA, Shannon TSAI, Michael L. KOCHMAN, Michael A. HOLLINGSWORTH, Andrew D. RHIM a Brian J. KIRBY. Microfluidic immunocapture of circulating pancreatic cells using parallel EpCAM and MUC1 capture: characterization, optimization and downstream analysis. Lab on a Chip [online]. 2014, 14(10), 1775–1784. ISSN 1473-0189. Dostupné z: doi:10.1039/c4lc00041b

Modelové buněčné kultury a nanočásticové systémy

Oblast nanotechnologií je dnes jedním z nejrychleji se rozvíjejících oborů moderní vědy. Ruku v ruce s novými rozmanitými aplikacemi nanostruktur, například nanočástic (NPs), které vykazují obrovský potenciál zejména v biomedicíně, se objevují otázky o jejich možném negativním vlivu na živé organismy.


Obr. 1: konfokální mikroskop (TCS SP5 X, Leica)

In vitro buněčné kultury jako pokusný model mají dnes již své pevné a nenahraditelné postavení a patří v současné době mezi základní techniky používané v základním i aplikovaném výzkumu. S použitím buněčných kultur a přístrojového vybavení, jímž naše pracoviště disponuje, jsme schopni relativně jednoduše, levně a rychle analyzovat cytotoxicitu (MTT, ATP, CV testy aj.) různorodých nanočásticových systémů a také jejich potenciální funkčnost jako vektorů (FACS, fluorescenční mikroskopie, qRT-PCR, konfokální mikroskopie aj.), neboli nosičů terapeutických agens (nukleových kyselin, léčiv aj.), jež přináší novou naději v boji proti některým geneticky podmíněným onemocněním anebo rakovině.

Obr. 2: buněčná kultura

Práce s buněčnými kulturami se v řadě aspektů liší od jiných laboratorních technik, což může jejich použití znesnadňovat. Laboratoř musí disponovat poměrně nákladným technickým vybavením, které navíc potřebuje pravidelný a rovněž relativně nákladný servis. Používá se zvláštní jednorázový spotřební materiál, který je o něco dražší než srovnatelné jednorázové pomůcky pro běžné použití. Rovněž voda, chemikálie pro kultivaci buněk musí být prosté některých běžných kontaminantů (např. některých přechodných kovů, endotoxinu a dalších organických molekul apod.). Většinou se používají reagencie přímo určené a testované pro buněčné kultury. V neposlední řadě pracovníci, kteří buněčné kultury pěstují, musejí být náležitě vyškoleni a pravidelně doškolováni, aby dokázali dodržet veškeré požadavky na čistotu a přesnost práce. Práce s buněčnými kulturami bývá často velmi zdlouhavá a přitom mimořádně náročná na soustředění a pozornost. Kultivace buněk proto patří mezi techniky, které jsou poměrně drahé a náročné na personální zajištění, organizaci i čas. [1, 2]

Obr. 3: MTT kolorimetrický test

Zdrojem buněk pro založení kultury musí pochopitelně být laboratorní zvíře nebo člověk (méně často se používají kultury buněk hmyzu a rostlinné buněčné kultury). První kulturu izolovaných buněk označujeme jako primární kulturu neboli primokulturu. Poté, co se buňky namnoží, se naředí a přenesou do nových kultivačních nádob – tento postup obvykle označujeme jako pasážování a vzniká jím tzv. sekundární kultura čili subkultura. Buňky v sekundární kultuře se pěstují tak dlouho, až získáme dostatečné množství materiálu pro pokus. Pokud jde o zakládání primokultury, můžeme rozlišit buňky pocházející z normální a z nádorové tkáně. Nádorové buňky se svými vlastnostmi pochopitelně liší od normálních buněk – zpravidla se lépe množí a obecně se snáze kultivují. Kultury normálních buněk mají omezenou životnost, po několika pasážích dochází k tzv. “zestárnutí kultury”, kdy buňky změní svoje vlastnosti a přestanou se dělit. Nádorové buňky většinou stárnutí nepodléhají. Odlišně se také chovají buňky izolované z dospělého jedince a z embrya. Embryonální buňky se opět snáze pěstují a kultury, které z nich vycházejí, mají zpravidla výrazně delší životnost, bývají však náchylnější ke změnám fenotypu (soubor všech pozorovatelných vlastností a znaků živého organismu). [1, 2, 3, 4]

Obr. 4: snímek transfekovaných buněk z konfokálního mikroskopu (Leica)

Využití těchto kultur má ve srovnání s jinými typy biologických modelů mnoho nesporných výhod. Řadu buněčných linií lze snadno kultivovat a v krátké době je tedy možné získat poměrně velké množství přesně definovaného a homogenního materiálu, což při práci s jinými biologickými modely bývá obtížné. Pokus probíhá na jediném, dobře charakterizovaném buněčném typu a jeho výsledky nejsou ovlivněny interakcí s jinými orgány, tkáněmi či buněčnými populacemi (v mnohých případech žádoucí). Navíc lze na kultivovaných buňkách také bez nesnází provádět experimenty, při nichž dojde k jejich zničení (bez etického zatížení).

Obr. 5.: průtokový cytometr (Attune NxT, Invitrogen)

Kontakty:

Mgr. Jan Malý, Ph.D., jan.maly@ujep.cz, PřF UJEP
Mgr. Dominika Wrobel, Ph.D., dominika.wrobel@ujep.cz, PřF UJEP
Mgr. Regina Herma, hermaregina@gmail.com, PřF UJEP
Mgr. Jiří Smejkal, jiri.smejkal@ujep.cz,PřF UJEP

Projekty MATEQ
Výzkumné týmy MATEQ