Oblast nanotechnologií je dnes jedním z nejrychleji se rozvíjejících oborů moderní vědy. Ruku v ruce s novými rozmanitými aplikacemi nanostruktur, například nanočástic (NPs), které vykazují obrovský potenciál zejména v biomedicíně, se objevují otázky o jejich možném negativním vlivu na živé organismy.
Obr. 1: konfokální mikroskop (TCS SP5 X, Leica)
In vitro buněčné kultury jako pokusný model mají dnes již své pevné a nenahraditelné postavení a patří v současné době mezi základní techniky používané v základním i aplikovaném výzkumu. S použitím buněčných kultur a přístrojového vybavení, jímž naše pracoviště disponuje, jsme schopni relativně jednoduše, levně a rychle analyzovat cytotoxicitu (MTT, ATP, CV testy aj.) různorodých nanočásticových systémů a také jejich potenciální funkčnost jako vektorů (FACS, fluorescenční mikroskopie, qRT-PCR, konfokální mikroskopie aj.), neboli nosičů terapeutických agens (nukleových kyselin, léčiv aj.), jež přináší novou naději v boji proti některým geneticky podmíněným onemocněním anebo rakovině.
Obr. 2: buněčná kultura
Práce s buněčnými kulturami se v řadě aspektů liší od jiných laboratorních technik, což může jejich použití znesnadňovat. Laboratoř musí disponovat poměrně nákladným technickým vybavením, které navíc potřebuje pravidelný a rovněž relativně nákladný servis. Používá se zvláštní jednorázový spotřební materiál, který je o něco dražší než srovnatelné jednorázové pomůcky pro běžné použití. Rovněž voda, chemikálie pro kultivaci buněk musí být prosté některých běžných kontaminantů (např. některých přechodných kovů, endotoxinu a dalších organických molekul apod.). Většinou se používají reagencie přímo určené a testované pro buněčné kultury. V neposlední řadě pracovníci, kteří buněčné kultury pěstují, musejí být náležitě vyškoleni a pravidelně doškolováni, aby dokázali dodržet veškeré požadavky na čistotu a přesnost práce. Práce s buněčnými kulturami bývá často velmi zdlouhavá a přitom mimořádně náročná na soustředění a pozornost. Kultivace buněk proto patří mezi techniky, které jsou poměrně drahé a náročné na personální zajištění, organizaci i čas. [1, 2]
Obr. 3: MTT kolorimetrický test
Zdrojem buněk pro založení kultury musí pochopitelně být laboratorní zvíře nebo člověk (méně často se používají kultury buněk hmyzu a rostlinné buněčné kultury). První kulturu izolovaných buněk označujeme jako primární kulturu neboli primokulturu. Poté, co se buňky namnoží, se naředí a přenesou do nových kultivačních nádob – tento postup obvykle označujeme jako pasážování a vzniká jím tzv. sekundární kultura čili subkultura. Buňky v sekundární kultuře se pěstují tak dlouho, až získáme dostatečné množství materiálu pro pokus. Pokud jde o zakládání primokultury, můžeme rozlišit buňky pocházející z normální a z nádorové tkáně. Nádorové buňky se svými vlastnostmi pochopitelně liší od normálních buněk – zpravidla se lépe množí a obecně se snáze kultivují. Kultury normálních buněk mají omezenou životnost, po několika pasážích dochází k tzv. “zestárnutí kultury”, kdy buňky změní svoje vlastnosti a přestanou se dělit. Nádorové buňky většinou stárnutí nepodléhají. Odlišně se také chovají buňky izolované z dospělého jedince a z embrya. Embryonální buňky se opět snáze pěstují a kultury, které z nich vycházejí, mají zpravidla výrazně delší životnost, bývají však náchylnější ke změnám fenotypu (soubor všech pozorovatelných vlastností a znaků živého organismu). [1, 2, 3, 4]
Obr. 4: snímek transfekovaných buněk z konfokálního mikroskopu (Leica)
Využití těchto kultur má ve srovnání s jinými typy biologických modelů mnoho nesporných výhod. Řadu buněčných linií lze snadno kultivovat a v krátké době je tedy možné získat poměrně velké množství přesně definovaného a homogenního materiálu, což při práci s jinými biologickými modely bývá obtížné. Pokus probíhá na jediném, dobře charakterizovaném buněčném typu a jeho výsledky nejsou ovlivněny interakcí s jinými orgány, tkáněmi či buněčnými populacemi (v mnohých případech žádoucí). Navíc lze na kultivovaných buňkách také bez nesnází provádět experimenty, při nichž dojde k jejich zničení (bez etického zatížení).
Obr. 5.: průtokový cytometr (Attune NxT, Invitrogen)
Kontakty:
Mgr. Jan Malý, Ph.D., jan.maly@ujep.cz, PřF UJEP
Mgr. Dominika Wrobel, Ph.D., dominika.wrobel@ujep.cz, PřF UJEP
Mgr. Regina Herma, hermaregina@gmail.com, PřF UJEP
Mgr. Jiří Smejkal, jiri.smejkal@ujep.cz,PřF UJEP